路易吉·里卡迪 1 , 羅莎·馬澤奧 2,*©, 安吉洛·拉ff埃萊·馬科特里吉亞諾 1 , 古列爾莫·雷納爾迪 3 保羅·約維諾 4 , 維托·佐諾 1 , 斯特凡諾·帕萬 1© 和康塞塔·洛蒂 2,*
- 1 巴里大學植物遺傳育種單位土壤、植物和食品科學系,Via Amendola 165/A, 70125 巴里,義大利; luigi.ricciardi@uniba.it (LR);Angelo.marcotrigiano@uniba.it (手臂); vito.zonno@uniba.it (VZ); stefano.pavan@uniba.it (SP)
- 2 福賈大學農業、食品與環境科學系,Via Napoli 25, 71122 Foggia, Italy
- 3 巴里大學生物科學、生物技術和生物製藥系,Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy; guglielmo.rainaldi@uniba.it
- 4 能源技術部,生物能源、生物精煉和綠色化學部,ENEA Trisaia 研究中心,SS 106 Ionica, km 419+500, 75026 Rotondella (MT),義大利; paolo.iovieno@enea.it
* 對應: rosa.mazzeo@unifg.it (R M); concetta.lotti@unifg.it (CL)
摘要:
洋蔥 (洋蔥 L.) 是世界上第二重要的蔬菜作物,因其健康益處而受到廣泛讚賞。儘管洋蔥具有重要的經濟重要性和作為功能性食品的價值,但其遺傳多樣性的研究卻很少。在此,我們調查了「Acquaviva紅洋蔥」(ARO)的遺傳變異,這是一種在巴里省(義大利南部普利亞大區)小鎮上擁有百年種植歷史的地方品種。使用一組 11 個微衛星標記來探索由 13 個 ARO 群體和 XNUMX 種常見商業類型組成的種質庫中的遺傳變異。使用參數和非參數方法對遺傳結構進行的分析強調,ARO 代表了一個明確的基因庫,與經常被誤認為的特羅佩亞和蒙托羅地方品種明顯不同。為了提供通常用於新鮮消費的球莖的描述,對可溶性固形物含量和刺激性進行了評估,顯示 ARO 相對於上述兩種地方品種具有更高的甜度。總體而言,本研究對於 ARO 的未來增值很有用,可以透過品質標籤來促進 ARO 的增值,從而有助於限製商業詐欺並提高小農的收入。
簡介
蔥屬包括約 750 種 [1],其中洋蔥 (Allium cepa L., 2n = 2x =16) 是分佈最廣泛的物種之一。 A. cepa 有兩年一次的循環和異交繁殖行為。如今,洋蔥的全球產量(97.9 公噸)使其成為僅次於番茄的第二重要蔬菜作物 [2]。自古以來,洋蔥球莖就被用作食品和民間藥用。事實上,古埃及人已經在公元前 1550 年的醫學紙莎草紙《埃伯斯法典》中報導了幾種基於大蒜和洋蔥使用的治療配方 [3]。
這種多功能且健康的蔬菜可以生吃、新鮮食用或作為加工產品食用,並用於增強許多菜餚的風味。最近的幾項研究聲稱,食用洋蔥可以降低心血管疾病[4,5]、肥胖[6]、糖尿病[7]和各種癌症[8-10]的風險。洋蔥的健康特性通常歸因於高含量的兩類營養化合物:類黃酮和烷(烯)基半胱氨酸亞砜(ACSO)。第一類包括黃酮醇和花青素。槲皮素是主要可檢測的黃酮醇,以其在自由基清除和過渡金屬離子結合方面的強抗氧化和抗炎特性而聞名 [11];而花青素則賦予某些洋蔥品種紅色/紫色。對於 ACSO,最豐富的是異蒜氨酸 [(+)-反式-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜] [12],一種儲存在細胞中的非揮發性、非蛋白性硫氨基酸,間接導致洋蔥的辛辣香氣和味道 [13]。組織破壞後,異蒜氨酸被蒜氨酸酶裂解,產生一系列揮發性化合物(丙酮酸鹽、氨、硫代磺酸鹽和丙硫醛S-氧化物),這些化合物會引起撕裂並產生難聞的氣味(刺鼻) [14]。洋蔥辛辣度通常以每克鮮重水解產生的丙酮酸的量來衡量 [15,16].
在地中海盆地國家,提議作為第二多樣性中心之一 A. cepa [17,18],洋蔥球莖在形狀、大小、顏色、乾物質和刺激性方面表現出很大的變化 [19-一]。此外,硫肥、農藝實踐、土壤類型、氣候條件以及品種或地方品種的基因型可以透過賦予特殊的感官和營養價值來影響球莖的質量 [23-一]。在義大利,儘管洋蔥種原廣泛,但只有少數洋蔥品種經常接受科學研究並正確表徵 [28,29].
農業生物多樣性的徹底遺傳和表型特徵對於確保植物遺傳資源的適當保護和促進特定基因型在價值鏈中的使用至關重要 [30-一]。通常選擇簡單序列重複 (SSR) 標記進行作圖 [33-一]、DNA指紋分析和品種鑑別 [36-一],以及地方品種內部和之間遺傳變異的可靠估計 [39-一],因為它們是位點特異性的、多等位基因的、共顯性遺傳的、高度可重複的並且適合自動基因分型。
在本研究中,我們將注意力集中在阿普利亞傳統地方品種“Acquaviva 紅洋蔥”(ARO)上,該品種是在巴里省 Acquaviva delle Fonti 鎮的一小片地區按照有機耕作方法種植的。 (普利亞,義大利南部)。這種地方品種的球莖大而扁平,呈紅色,主要用於當地食譜。儘管ARO 獲得了「慢食主席團」品質標誌,但其生產可以透過歐盟品質標誌(例如受保護的地理標誌(PGI)和受保護的原產地名稱(POD))進一步促進和保護,因為這些可能有助於限製商業詐欺並提高小農的收入。在此,SSR 分子標記被用作評估 ARO 群體之間遺傳變異的強大工具,並將該地方品種與其他兩種義大利南部紅洋蔥地方品種區分開來。此外,我們也估計了辛辣味和可溶性固形物含量,以評估 ARO 風味與市場需求的關係。
成績
Acquaviva紅洋蔥種質資源庫的建立與形態學表徵
農民在 BiodiverSO 普利亞地區計畫框架內捐贈的 13 個 ARO 地方品種族群的種子被用來建立 ARO 種質庫。
在ARO 種質和三種洋蔥地方品種中收集了與球莖、皮膚和果肉相關的形態描述符,其中兩種屬於「特羅佩亞紅洋蔥」(TRO) 地方品種,一種屬於「蒙托羅銅洋蔥」(MCO) 地方品種(圖 1)。所有 ARO 球莖都是扁平的,其特徵是紅色的外皮和果肉具有不同的紅色深淺。相較之下,TRO 球莖的果肉是全紅色的,而 MCO 球莖的果肉顏色則很差(表 S1)。生化分析可以評估固體可溶物含量和刺激性。如表所示 1, ARO群體中球莖的固溶物含量平均值為7.60,範圍為6.00(ARO12)至9.50°白利糖度(ARO11和ARO13)。該值高於 TRO 和 MCO 地方品種的估計值(分別為 4.25 和 6.00° Brix)。
表1。 在「Acquaviva 紅洋蔥」(ARO)、「Tropea 紅洋蔥」(TRO) 和「Montoro 銅洋蔥」(MCO) 群體中評估的固體可溶物含量和刺激性值*。
CODE | 可溶性固體含量(糖度) | 辛辣味(p莫爾格 - 1 韌體) | ||
意思 | CV y (%) | 意思 | CV y (%) | |
阿羅1 | 6.25D * | 5.65 | 5.84 ab * | 23.78 |
阿羅2 | 7.25 DC | 4.87 | 6.51“ | 22.98 |
阿羅3 | 7.50 BCD | 9.42 | 5.28 抗體 | 22.88 |
阿羅4 | 7.50 BCD | 0.00 | 6.97“ | 3.74 |
阿羅5 | 7.50 BCD | 0.00 | 6.80“ | 9.68 |
阿羅6 | 6.25ð | 5.65 | 4.51 抗體 | 39.18 |
阿羅7 | 7.25 DC | 4.87 | 5.25 抗體 | 15.44 |
阿羅8 | 9.00 AB | 0.00 | 7.04“ | 3.49 |
阿羅9 | 8.25個ABC | 4.28 | 6.84“ | 0.15 |
阿羅10 | 7.00 DC | 0.00 | 5.94 抗體 | 6.57 |
阿羅11 | 9.50A | 7.44 | 5.54 抗體 | 16.43 |
阿羅12 | 6.00ð | 0.00 | 4.91 抗體 | 9.70 |
阿羅13 | 9.50A | 7.44 | 6.63“ | 24.93 |
MCO | 6.00ð | 0.00 | 4.18 抗體 | 2.66 |
特羅1 | Ë4.25 | 8.31 | 2.80 b | 2.10 |
特羅2 | Ë4.25 | 8.31 | 4.28 抗體 | 4.79 |
* 具有相同大寫或小寫字母的平均值分別在 0.01P 或 0.05P 時沒有統計學差異(SNK 測試)。 y 變異係數。
以丙酮酸含量評估的 ARO 刺激性平均值為 6.00,範圍為 4.51 pmol g-1 韌體 (ARO6) 至 7.04 (ARO8)。該值高於 TRO 和 MCO 地方品種的估計值(3.54 pmol g-1 FW 和 4.18 pmol g-1 分別為FW)。
SSR多態性與種質間的遺傳關係
在本研究中,11個測試的SSR引子組合中有37個提供單基因座多態性,即在單一個體中產生最多兩個擴增產物。總體而言,在55 名個體中檢測到320 個等位基因,每個位點的等位基因數量範圍從2 個(ACM147 和ACM 504)到11 個(ACM132),平均值為5 個等位基因(表 2)。在個體群體中,等位基因數量 (Na) 的範圍為 1.94 (ACM147 和 ACM504) 至 5.38 (ACM132),而等位基因的有效數量 (Ne) 的範圍為 1.41 (ACM152) 至 2.82 (ACM449)。差異 Na 和 Ne 值之間的差異是由於群體中存在頻率較低的等位基因,並且僅少數等位基因占主導地位。觀察到的最高雜合度 (Ho) 值突出顯示為 ACM138 和 ACM449 (0.62),而最低雜合度 (Ho) 值與 ACM152 (0.25) 相關。預期雜合度 (He) 對應於恐慌群體的理論預期,範圍為 0.37 (ACM504) 到 0.61 (ACM132、ACM138 和 ACM449)。賴特固定指數 (Fis) 顯示所有標記的值接近零(平均 0.05),表明觀察到的雜合性水平與預期雜合性水平之間的值相似,正如對異交物種的預期一樣。單一SSR標記在遺傳指紋中的效率透過多態性資訊內容(PIC)指數來估計,平均值為0.48,範圍為0.33(ACM504)至0.67(ACM132)。另一個效率指數,香農資訊指數 (I),其平均值為 0.84,假設值範圍為 0.45 (ACM152) 到 1.20 (ACM132)。
表2。 用於估計 ARO、TRO 和 MCO 群體遺傳多樣性的 11 個 SSR 標記的多態性特徵。等位基因總數 (Na)、條帶大小範圍和多態性資訊內容 (PIC) 指數指的是本研究中基因分型的 320 個人的總集。等位基因數 (Na)、有效等位基因數 (Ne)、觀測雜合度 (Ho)、預期雜合度 (He)、固定指數 (F)is),香農資訊指數(I)是指從 16 個群體計算得出的平均值,每個群體由 20 個個體組成。
軌跡。 | 總鈉 | 尺寸範圍(bp) | PIC | 意思 | |||||
Na | Ne | Ho | He | I | Fis | ||||
ACM91 | 4 | 189-205 | 0.40 | 2.63 | 1.72 | 0.38 | 0.39 | 0.66 | 0.04 |
ACM101 | 4 | 229-241 | 0.52 | 2.94 | 2.37 | 0.53 | 0.56 | 0.92 | 0.06 |
ACM132 | 11 | 186-248 | 0.67 | 5.38 | 2.78 | 0.55 | 0.61 | 1.20 | 0.09 |
ACM138 | 5 | 242-272 | 0.66 | 3.69 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.09 | -0.02 |
ACM147 | 2 | 264-266 | 0.37 | 1.94 | 1.83 | 0.44 | 0.44 | 0.62 | -0.01 |
ACM152 | 4 | 228-244 | 0.25 | 2.38 | 1.41 | 0.25 | 0.27 | 0.45 | 0.07 |
ACM235 | 4 | 286-298 | 0.41 | 2.81 | 1.77 | 0.44 | 0.41 | 0.72 | -0.06 |
ACM446 | 6 | 108-120 | 0.56 | 3.50 | 2.48 | 0.49 | 0.58 | 1.01 | 0.16 |
ACM449 | 8 | 120-140 | 0.66 | 4.88 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.18 | -0.03 |
ACM463 | 5 | 202-210 | 0.47 | 3.38 | 1.95 | 0.46 | 0.48 | 0.83 | 0.05 |
ACM504 | 2 | 188-192 | 0.33 | 1.94 | 1.64 | 0.30 | 0.37 | 0.54 | 0.20 |
意思 | 5 | 0.48 | 3.22 | 2.15 | 0.46 | 0.48 | 0.84 | 0.05 |
在族群中,ARO3、ARO6、ARO8、ARO10、TRO1 和 MCO 顯示出高水準的遺傳變異(Ho > 0.5),而在族群 ARO7 中觀察到最低的多樣性(Ho = 0.27)(補充表 S2)。總體而言,所有材料均顯示 Fis 值接近零(Fis 平均值 = 0.054),如隨機交配條件下的預期。
分子變異和遺傳結構分析
透過 AMOVA 計算群體間和群體內遺傳變異的層次劃分。結果突顯了群體內很大一部分遺傳變異(87%)。人群之間的差異非常顯著(13XNUMX%)P < 0.001)(表 3)。 Fpt 參數的成對值(類似於賴特 Fst 固定指數),範圍從 0.002 (ARO2/ARO10) 到 0.468 (ARO7/TRO2),具有顯著性(P < 0.05),九個成對比較除外(補充表 S3)。
表3。 320 個族群的 16 個基因型的分子變異分析 洋蔥 L.
資源 | df | 平方和 | 變異數估計 | 變異數(%) | Fpt | P |
在人群中 | 15 | 458.63 | 1.16 | 13% | ||
在人群中 | 304 | 2272.99 | 7.50 | 87% | 0.134 | 0.001 |
Total | 319 | 2731.62 | 8.66 |
基因結構的研究 A. cepa 本研究中的收集基因分型是透過軟體 STRUCTURE 中實施的基於混合模型的聚類分析來進行的。 Evanno AK 方法建議細分為兩個簇 (K = 2),作為我們的資訊最豐富的方法 數據集,與the 下 最高體育AK 在 K = 5 (補充圖 S1)。 一 叉 = 2, a生命值op法規w埃雷屁股igned 也nØf 兩個簇 rnernbertoip 係數 (q) > 0.7。作為ho我在 數字 2a,第一個簇(名為 S1)包括 MCO 和所有 ARO 族群,而 S2 簇將兩個 TRO 族群分組。在 K = 5 時,提供對資料集更深入的描述(圖 2b),75% 的種質被分配到五個簇之一。儘管一些 ARO 群體混合 (q < 1) 或單獨分組在兩個新簇 S2 和 S0.7(分別為 ARO3 和 ARO4)中,但 ARO (S7) 和 TRO (S12) 之間的分離得到了證實。有趣的是,MCO 商業類型形成了與阿普利亞紅洋蔥分開的獨特簇(S5)。
人群之間的遺傳關係
SSR多態性可以繪製遺傳多樣性樹狀圖,系統發育分析結果如圖所示 3a。在這裡,種質收集被分為五組,並得到引導值的強烈支持。 ARO7 和 ARO12 種群立即與其餘種群分離並形成兩個不同的簇。第三個集群包括TRO的兩個商業群體,同時第四個節點將MCO從XNUMX個ARO群體中劃分出來。透過主座標分析(PCoA)進一步研究了族群之間發生的遺傳關係(圖 3b)。如前所述,ARO 群體緊密分組,但 ARO12 和 ARO7 除外,它們出現在 PCoA 圖中的孤立位置。兩個 TRO 和 MCO 群體分散在圖的右下圖。
圖3。 16 種基因的遺傳多樣性 A. cepa 本研究中根據其 SSR 概況對人群進行了表徵。 (a) 遺傳距離的 UPGMA 樹狀圖。 Bootstrap 支援值 >50 會在對應節點上方標示; (b) 主成分分析 (PCoA)。紅色圈起來的簇與系統發育分析產生的組別完全匹配,由 11 個 ARO 種質組成。
討論區
在義大利南部傳統種植的大量農業生物多樣性中,洋蔥地方品種代表了需要保護的利基產品,以免受遺傳侵蝕的風險和現代品種替代的威脅。在 BiodiverSO 區域計畫的框架內,我們建立了 13 個 ARO 地方品種的種子庫,旨在收集、描述、推廣和保護普利亞地區與當地遺產密切相關的遺傳資源。我們報告了根據 DNA 多態性和兩個生化參數(可溶性固形物和丙酮酸含量)對 ARO 變異的首次評估,這些參數與風味特徵相關,對於新鮮生產品的接受度具有重要意義。此外,還將 ARO 地方品種的數據與其他兩種常被誤認為是的色素洋蔥地方品種收集的數據進行了比較。
根據甜洋蔥產業指南,生化分析強調了 13 個 ARO 群體的甜度,與高可溶性固形物含量和中等刺激性相關 [31]。 ARO 球莖比 TRO 和 MCO 地方品種的球莖更甜,並且表現出稍微高的刺激性。然而,洋蔥的甜味是由於糖含量和辛辣味之間的平衡而產生的,因此這種表徵可能有助於支持有價值的基因型的選擇,通常由農民僅根據形態進行選擇。
SSR 標記被證實是區分基因型的有用工具,儘管是在 Acquaviva delle Fonti 鎮等狹窄的種植區域內收集的。所選標記顯示的等位基因數量比先前報告的標記要多 [43] 和 [44],但低於報告的標記 [45]。此外,我們的標記組中有 50% 顯示 PIC 指數值大於 0.5,證明適合區分集合中的群體,如 [46]。對族群內多樣性的評估顯示 Ho 和 He 之間具有相似的值,導致 Fi 較低s 價值觀。這與異型雜交的性質是一致的 A.cepa, 嚴重患有近親繁殖憂鬱症 [47]。整體Fis 本研究中考慮的洋蔥族群計算值 (0.054) 低於先前報告的值 [45] (0.22) 幾乎與由 [31] (0.08)和 [48] (0.00) 他們分別評估了來自西班牙西北部和尼日的洋蔥地方品種的遺傳多樣性。 ARO 種群中值得注意的雜合性水平強化了普利亞代表許多園藝物種多樣性中心的觀念 [32,42,49-一].
AMOVA 強調,本研究中基因分型的集合中的大多數分子變異都存在於人群中。然而,族群之間存在顯著的遺傳分化(FPT 值)揭示了遺傳分層的發生。事實上,儘管我們的結果表明大多數 ARO 群體存在遺傳一致性,形成明確的簇,但 ARO7 和 ARO12 群體表現出明顯不同的遺傳特徵。這結果可能是由於收集族群的兩個農民所使用的種子來源不同所致。此外,根據所獲得的結果,可以認為 ARO 地方品種在遺傳層面上與 TRO 和 MCO 地方品種明顯不同。在最近的一項研究中, [29] 評估了幾種義大利洋蔥地方品種的遺傳多樣性,包括“Acquaviva”、“Tropea”和“Montoro”。儘管作者使用 SNP 標記來評估更廣汎洋蔥收藏的遺傳多樣性,但基因分型無法區分「Acquaviva」與「Tropea」和「Montoro」洋蔥。可能,這種差異是由於發現的平均 PIC 值較低 (0.292),這表明所分析的基因座的一般資訊量不大,如 [29]。此外,為了調查義大利集群中子結構的存在,最好將義大利基因型與集合的其餘部分分開分析。也許它可以使與地理分層或經驗選擇下的性狀相關的遺傳多樣性模式可視化。
總之,本研究是關於與當地文化遺產相關且對農民具有經濟重要性的洋蔥地方品種的綜合報告。我們的結果強調,除了少數例外,ARO 的特徵是有一個明確的基因庫,值得保護,免受遺傳侵蝕的風險。因此,建立這一寶貴的遺傳多樣性來源的代表性收藏至關重要。最後,ARO 的遺傳和表型特徵可能有助於獲得歐盟的品質標誌。
材料和方法
種質採集、植物材料和 DNA 萃取
一組 13 個 ARO 地方品種族群是在普利亞地區計畫框架內獲得的(BiodiverSO: https://www.biodiversitapuglia.it/),透過在義大利巴里省阿普利亞小鎮「Acquaviva delle Fonti」執行的一系列任務。透過地理資訊系統(GIS)繪製每個種質的收集地點並在表中報告 4. 此外,本研究還包括兩個來自 TRO 地方品種的群體和一個來自 MCO 地方品種的群體,並用作參考。所有植物材料均在巴里大學實驗農場“P Martucci”(41° 1'22.08” N,16°54'25.95” E)在相同的環境條件下生長,在保護籠下以避免異花授粉種群並通過蒼蠅確保族群內授粉 (露西莉亞凱撒)。 對 16 個族群的特徵進行了與鱗莖大小、形狀以及皮膚和肉色相關的性狀的表徵(表 S1)。此外,使用手持式折射儀進行固溶物含量測定,並測量添加 2,4-二硝基苯肼(0.125%)的洋蔥汁樣本的刺激性。 v/v 在 2N HCl 中)並評估 420 nm 處的吸光度,如 [31]。進行鄧肯多範圍檢定和SNK檢定以確定是否有顯著差異。
表4。 本研究中收集和基因分型的人群列表。對於每個族群,都會報告識別碼、本地名稱、GPS 座標和保存種子的基因庫。
推薦碼 | 姓名 | GPS坐標 | 基因庫 y |
阿羅1 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°54’21.708″ N 16°49’1.631” E | 雙SSPA |
阿羅2 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°53’14.28″ N 16°48’56.879” E | 雙SSPA |
阿羅3 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°54’11.304″ N 16°49’13.079” E | 雙SSPA |
阿羅4 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°54’3.348″ N 16°40’27.011” E | 雙SSPA |
阿羅5 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°51’59.76″ N 16°53’0.527” E | 雙SSPA |
阿羅6 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°52’48.72″ N 16°49’43.247” E | 雙SSPA |
阿羅7 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°53’13.47″ N 16°50’23.783” E | 雙SSPA |
阿羅8 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°53’18.816″ N 16°49’33.888” E | 雙SSPA |
阿羅9 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°54“51.372吋N 16°49“3.504“ E | 雙SSPA |
阿羅10 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°54’1.188″ N 16°49’24.311” E | 雙SSPA |
阿羅11 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°52“49.8吋N 16°49“48.575“ E | 雙SSPA |
阿羅12 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°52’38.892″ N 16°49’28.379” E | 雙SSPA |
阿羅13 | 阿誇維瓦紅花菜 | 40°53’21.768″ N 16°49’29.711” E | 雙SSPA |
特羅1 | 特羅佩亞紅花鷸 | - | 雙SSPA |
特羅2 | 特羅佩亞紅西波拉 | - | 雙SSPA |
MCO | 蒙托羅西波拉瑪塔 | - | 雙SSPA |
y Di.SSPA,巴里大學土壤、植物和食品科學系。 |
對每個族群 20 個基因型的葉子材料進行取樣並儲存在 -80°C 下直至使用。對於富含多醣體的物種,如 A.cepa, 去除多醣的第一步對於獲得優質 DNA 至關重要,因此請按照以下所述在 STE 緩衝液(0.25 M 蔗糖、0.03 M Tris、0.05 M EDTA)中進行初始洗滌 [52]。 CTAB法萃取總DNA [53] 最後用 Nano Drop 2000 紫外可見分光光度計 (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) 和 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢查品質和濃度。
SSR分析
開發的 16 個 EST-SSR 引子組合 [54] 先前在遺傳多樣性研究中進行了測試 [43] 和 [44] 和21個基因組SSR [45-一] 進行篩選以評估其適用性(補充表 S4)。使用經濟螢光標記方法進行基因分型,其中將 M13 尾添加到每個正向 SSR 引子中 [56]。 PCR 混合物在20 gL 反應系統中製備,其中包含:50 ng 總DNA、0.2 mM dNTP 混合物、1X PCR 反應緩衝液、0.8 U DreamTaq DNA 聚合酶(Thermo Scientific,沃爾瑟姆,馬薩諸塞州,美國)、 0.16 gM 反向引子、0.032 gM 延伸有M13 序列的正向引子(5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') 和0.08 gM 標記有FAM 或NED 螢光染料的通用M13 引子(Sigma-Aldrich,聖路易斯,密蘇裡州,美國)。 PCR 反應在 SimpliAmp(Applied Biosystems,CA,USA)熱循環儀中進行,大多數引子對的條件如下:94°C 5 分鐘,40°C 94 秒 30 個循環,58°C 45 秒和72°C 45 秒,最終伸長率在72°C 5 分鐘。對於 ACM446 和 ACM449,施加降落 PCR,在 60 °C 至 55 °C 的溫度下退火 10 個循環,在 30 °C 下進行 55 個循環,然後在 5 °C 下最終延伸 72 分鐘。將PCR 產物裝入96 孔板中,並與14 gL Hi-Di 甲醯胺(Life Technologies,卡爾斯巴德,加州,美國)和0.5 gL GeneScan 500 ROX Size Standard(Life Technologies,卡爾斯巴德,加州,美國)混合。透過 ABI PRISM 3100 Avant 遺傳分析儀(Life Technologies,卡爾斯巴德,加利福尼亞州,美國)毛細管定序機解析擴增子,其中等位基因被評分為共顯性,並使用 GeneMapper 軟體版本 3.7 進行分配。
軟體 GenAlEx 6.5 [57] 和鹿3.0.7 [58] 用於估計等位基因數量(Na)、有效等位基因數量(Ne)、觀測雜合度(Ho)、預期雜合度(He)、多態性資訊內容(PIC)、香農資訊指數(I) 和固定指數(Fis) )對於每個 SSR 位點。
遺傳多樣性評估
GenAlEx 6.5 評估了洋蔥群體之間和內部遺傳變異的分層劃分 [57] 以分子變異數分析 (AMOVA) 和 999 bootstrapping 來檢定顯著性。此外,使用 GenAlEx 6.5 軟體透過計算所有 SSR 位點上 Ho、He 和 Fis 的平均值來估計每個群體內的多樣性。
透過 STRUCTURE v.2.3.4 軟體中實現的基於貝葉斯模型的聚類演算法推斷群體結構 [59]。此資料集使用多個假設叢集 (K) 運行,範圍從 1 到 10,為每個 K 值設定 100,000 次獨立運行。為了驗證結果的一致性,每次運行均在混合模型和群際獨立等位基因頻率下進行了 100,000 次初始老化期和 XNUMX 次馬可夫鏈蒙特卡羅 (MCMC) 迭代。最可能的 K 值是透過 AK 方法確定的,描述為 [60],在基於網路的程式 STRUCTURE HARVESTER 中 [61]。當個體群體的隸屬係數(q值)高於0.7時,該個體群體被分配到特定的簇,否則被認為是混合血統。
進行主座標分析,以便視覺化 Nei 遺傳距離矩陣所揭示的種質之間的遺傳關係模式(補充表 S5)。基於等位基因頻率,在 POPTREEW 軟體中實施未加權配對算術平均法 (UPGMA) 聚類分析,建立遺傳距離樹狀圖 [62]。應用 Bootstrapping 來評估分層聚類的置信度,並設定資料集的 100 次重採樣。最後,MEGA X 軟體 [63] 被用作樹繪圖軟體。
補充材料: 以下內容可在線獲取 http://www.mdpi.com/2223-7747/9/2/260/s1. 表 S1:ARO、MCO 和 TRO 燈泡的形態特徵。表 S2:計算 ARO 地方品種和 TRO 和 MCO 地方品種的雜合性和固定指數。表 S3:Fpt 參數的成對值。表 S4:研究中使用的 SSR 清單。表 S5。 Nei 遺傳距離的成對群體矩陣。圖 S1:K 值隨 Evanno Delta K 變化的折線圖。
作者貢獻: CL和LR構思了研究並設計了實驗; CL和PI進行分子標記分析; ARM 和 VZ 進行了現場試驗; RM、SP、GR、CL參與資料分析; RM 和 CL 撰寫了手稿。所有作者均已閱讀並同意稿件的出版版本。
資金: 這項工作由阿普利亞地區計畫「阿普利亞蔬菜物種生物多樣性」——Programma di Sviluppo Rurale per la Puglia 2014-2020 資助。米蘇拉10—索托米蘇拉10.2;授予 CUP H92C15000270002,義大利。
致謝: 感謝“Azienda Agricola Iannone Anna”和“Associazione produttori della vera cipolla rossa di Acquaviva”提供了實驗中使用的植物材料。
利益衝突: 作者宣稱沒有利益衝突。
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